近年来，RNA修饰介导的基因表达调控是目前表观遗传研究领域的热点之一，而m6A RNA修饰又是其中最为主流的研究方向。小编凑巧看到了一篇杜克大学Kate Meyer课题组最近发表在Molecular Cell上关于单细胞m6A测序的文章《scDART-seq reveals distinct m6A signatures and mRNA methylation heterogeneity in single cells 》

素材来源《scDART-seq reveals distinct m6A signatures and mRNA methylation heterogeneity in single cells ，Kate Meyer》

“单细胞+m6A”，如果拿这个来做细胞分型岂不是美滋滋(*^_^*)，梦回单细胞测序技术刚出现时，CNS上各类牛文研究思路简直一模一样，尤其是发育生物学方面，简直就像换皮游戏。

现有的m6A修饰测序方法大都无法直接在单细胞水平进行。然而，m6A修饰在细胞发育和分化过程中的作用又至关重要。由此，作者创新了单细胞m6A测序技术并做了相关探索研究。在说这篇文献之前，我们先聊聊m6A测序的背景故事，介绍一下常用的m6A测序技术。

研究背景

最早出现并且目前应用较为广泛的是基于m6A抗体免疫共沉淀的m6A-seq技术(Dominissini et al., 2012)。方法就是通过oligo dT捕获mRNA，再将RNA片段化，然后使用m6A抗体富集含有m6A的RNA片段，从而进行下一步的RNA建库。这个最早出现方案的缺点是显而易见的：

1）分辨率低，确定m6A修饰的RNA片段大小只能在100nt左右；

2）不能定量，无法准确知晓甲基化序列的具体比例；

3）基于抗体的IP体系所需求的RNA起始量很大。

素材来源《Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq，Dan Dominissini》

大佬Dominissini 2012年的这一篇文章RNA起始量需求大（400µg mRNA or 2.5mg total RNA），大佬肯定也知道这么大的RNA起始量对于很多实验来说是不现实的。因此，Dominissini 很快2013年就出了另一篇文章来改善了起始量（5µg mRNA or 300µg total RNA），这就使得该方法得到了很大范围的应用。

 其实呢，除了Dominissini 2012年5月发表在NATURE上的这篇文章，还有一篇6月份发表在CELL上的文章《Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons》。这篇文章的第一作者就是今天提到的做单细胞m6A测序的主角Meyer教授本人，这时候他所用的技术在原理上和Dominissini教授的方法本质上差别不大。

但不管怎么说，上述的三篇文章可以说是第⼀次从转录水平，大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平，这两个方法的核心就是利用m6A抗体特异性结合带有m6A的mRNA片段后进行高通量测序，也是目前m6A测序商业化最成功的技术理论。

上述几篇文章中m6A测序技术都存在进一步优化的空间。因此，近年来一系列富有创造性改善m6A测序技术的文章如雨后春笋般地涌现，小编收集了现有的大部分m6A修饰测序方法（感谢北大化学系贾桂芳老师的综述文章：“RNA化学修饰m6A的生物功能研究进展”，极大减轻了小编的工作量），这些方法大致上可以分为两个思路。

第一种思路

第一种思路还是和最开始的文章一样建立在抗体富集的基础上:

利用抗体富集还想发高分文章那就卷得厉害了，包括像上述最后一篇文章”低起始量的MeRIP-seq”方法也只发表在PLOS Biology上，大家搞出各种花里胡哨的不依赖抗体的m6A测序方法也就不意外了。

第二种思路

第二种思路开始利用m6A的一些基序特征或m6A代谢上的特点：

DART-seq

m6A修饰基序具有很强的保守性：Rm6ACH (R=A/G，H=A/C/U)，被修饰的碱基A后面是一个保守的碱基C。那么如果将胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1，能进行C→U的转换）招募到m6A修饰的位点，那么APOBEC1将m6A修饰位点后的C变成U碱基，就能得到m6A修饰的具体位点。

但是APOBEC1不具备特异性识别m6A的能力，怎么将其招募到m6A修饰位点的呢？这时候就要用到另一个蛋白YTH家族蛋白（RNA甲基化阅读蛋白，Readers），YTH能特异性识别结合m6A的保守基序。

那么将YTH和APOBEC1组成融合蛋白，是不是就能特异性的将m6A修饰位点后的C→U，从而得到m6A修饰的具体位点呢？这就是DART-seq所使用的策略：将APOBEC1-YTH融合蛋白转入目的细胞，将细胞内m6A后的C→U，之后通过比对基因组信息，得到m6A修饰位点。

素材来源《DART-seq: an antibody-free method for global m6A detection，Kate Meyer》

其实这项技术的缺点也很明显，后面建立在这项技术上的scDART-seq其实也存在同样的问题：

1）DART-seq依赖于细胞转染效率，需要在细胞体内稳定过表达融合蛋白，样本受限于体外实验，并且不适用于不易或不能进行转染的实验样本；

2）使用YTH结构域的RNA底物中只有60%左右含有m6A，并且不是所有含有m6A的RNA都会被YTH结构域结合；

3）YTH结构域 与m6A结合后形成的空间位阻影响C→U的转化效率。

scDART-seq

scDART-seq是DART-seq的升级版，感觉似乎就是拿过表达APOBEC1-YTH融合蛋白的细胞做了一个单细胞测序，我们看看作者是怎么做的吧：

1.稳转细胞系与测序

1）为了确定DART-seq是否可以用于定位单个细胞中的m6A位点，作者在经典的HEK293T中创建了稳定表达APOBEC1-YTH的细胞系，同时使用APOBEC1-YTHmut（缺乏m6A结合域）作为对照用于分析脱靶结果。

2）在诱导表达后对大批量细胞进行DART-seq，通过Bullseye（识别C→U）来识别整个转录组的m6A位点；同时通过10×Genomics和Bullseye来识别单细胞中的m6A位点来进行对比。

2.DART-seq和scDART-seq结果比对

1）作者在10352个细胞的3844个RNA分子中发现了16934个高置信度m6A修饰位点，并且重复性良好。这些m6A位点和Bulk的m6A-seq检测结果高度一致，表明scDART-seq具有较高的准确性和重复性。

2）单细胞m6A位点表现出与Bulk水平相似的特征，包括在终止密码子附近和RAC(R=A/G)保守序列中的强富集。

素材来源《scDART-seq reveals distinct m6A signatures and mRNA methylation heterogeneity in single cells ，Kate Meyer》

然而，单个RNA被甲基化的细胞比例存在高度异质性：

1）例如TPT1和RPL34均在大多数细胞中呈现高表达，但是TPT1在大多数细胞中被甲基化，而RPL34却很少被甲基化。

2）上述基于10xGenomics的scDART-seq文库也进一步通过SMART-seq2验证。当然作者还做了其他实验来证实scDART-seq的可行性。

素材来源《scDART-seq reveals distinct m6A signatures and mRNA methylation heterogeneity in single cells ，Kate Meyer》

3.使用m6A测序结果进行细胞分群

小编终于看到重头戏了：利用scDART-seq分析不同细胞状态的甲基化模式。为了确定mRNA在整个细胞周期中是否存在差异甲基化，作者对处于G1、S和G2/M中的细胞进行鉴定：

整体上不同细胞周期中m6A水平没有显著性差异，但一部分转录本表现出与基因表达无关的随细胞周期m6A水平发生变化的现象，比如TET1和TOPBP1在不同细胞周期中表达量无明显差异，但是随细胞周期的进展在越来越多的细胞中甲基化。

素材来源《scDART-seq reveals distinct m6A signatures and mRNA methylation heterogeneity in single cells ，Kate Meyer》

拿到这个结果就可以说点故事了，既然RNA表达量已经无法区分这些细胞了，那么m6A修饰水平上的差异是不是就能掏出来区分细胞亚群了呢？

为了确认这点，作者使用scDART-seq的结果对细胞进行聚类分析：

揭示了两个不同的细胞簇（其实嘛，分群效果并不是很明显），且两个细胞簇差异甲基化位点所在的RNA大多编码参与RNA调控和结合的蛋白，说明编码RNA调节因子的转录本的甲基化可能有助于细胞分型。

素材来源《scDART-seq reveals distinct m6A signatures and mRNA methylation heterogeneity in single cells ，Kate Meyer》

嗯...怎么说呢，小编的确看见能依据m6A甲基化状态来进行细胞分群的文章，但是始终有一种意兴阑珊的感觉，毕竟从scDART-seq的结果看，这个方法到真正具有适用性还有一段距离。希望能早日看到更多的这类文章出来，从而从深处挖掘出细胞发育和分化的生物学奥秘。

在最近的一些m6A-seq方向的文章中，中国学者占比也是极大的，没什么好说的了，加油！